Western Blotting

western blotting

Western blotting là một kỹ thuật phân tích ứng dụng trong phát hiện, phân tích và định lượng protein. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi để phát hiện các phân tử protein trong các mẫu phức tạp như dịch chiết từ mô và chất ly giải tế bào. Western Blot phân tách protein bằng cách điện di trên gel, sau đó chuyển protein sang màng polyvinylidene difluoride (PVDF) hoặc nitrocellulose. Các protein đã được chuyển trên màng sẽ được nhuộm màu để dễ quan sát và được xác định trực tiếp bằng phương pháp giải trình tự đầu cuối N, khối phổ hoặc xét nghiệm miễn dịch.

Trong phương pháp Western Blotting, các protein được xác định thông qua liên kết của chúng với các kháng thể đặc hiệu. Thông thường, kháng thể sơ cấp được sử dụng kết hợp với kháng thể thứ cấp liên hợp HRP hoặc AP để phát hiện hóa chất phát quang hoặc đo màu bằng cách sử dụng chất nền thích hợp. Ngoài ra, có thể sử dụng kháng thể sơ cấp hoặc kháng thể thứ cấp được đánh dấu huỳnh quang để quan sát trực tiếp.

Western blotting được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực sinh hóa để phát hiện sự hiện diện của các protein cụ thể, để xác định mức độ của các sửa đổi sau dịch mã, để xác minh sự biểu hiện của protein trong các ứng dụng nhân bản, để phân tích mức độ biểu hiện của protein và dấu ấn sinh học, trong lập bản đồ biểu mô kháng thể và để kiểm tra dấu hiệu của bệnh trong xét nghiệm lâm sàng.

Nhu cầu phân tích đồng thời nhiều protein hơn trong các mẫu hạn chế đã thúc đẩy các nghiên cứu nhằm cải thiện độ nhạy và tốc độ của kỹ thuật này, ví dụ như:

  • Double blotting giúp loại bỏ dương tính giả gây ra bởi các tương tác không đặc hiệu.
  • Phương pháp Far-Western blotting cho phép phát hiện các tương tác protein-protein cụ thể.
  • Southwestern blotting được sử dụng để xác định các protein tương tác với các trình tự DNA cụ thể.
  • Multistrip blotting làm tăng thông lượng trong khi giảm thiểu sự thay đổi giữa các blot.

Các công nghệ mới đang được phát triển giúp giảm lượng protein tối thiệu để tạo ra tín hiệu và cải thiện khả năng định lượng của kỹ thuật Western Blotting.

QUY TRÌNH THỰC HIỆN WESTERN BLOTTING

Tải brochure toàn bộ danh mục sản phẩm cho Western Blotting tại đây

Khi làm việc với tế bào hoặc mô, các mẫu phải được phá vỡ để phân lập các protein trước khi phân tích. Bộ đệm ly giải và chiết tách sử dụng chất tẩy rửa để phá vỡ thành và màng tế bào để giải phóng protein. Nên lựa chọn bộ đệm tối ưu dựa trên loại mẫu và đặc tính protein đích trong tế bào.

Xem danh mục sản phẩm cho tách chiết protein tại đây

Tải brochure danh mục sản phẩm tách chiết protein tại đây

Giải pháp ức chế protease, tải brochure tại đây

Điện di gel protein được sử dụng để phân tách protein trước khi chuyển màng. Hỗn hợp protein được chạy trên gel polyacrylamide để phân tách protein theo trọng lượng phân tử và điện tích.

Bản gel polyacrylamide được hình thành dựa trên sự polymer hóa phản ứng acrylamide và bis-acrylamide. Bằng cách biến tính protein và tạo cực âm đồng nhất cho chúng, chúng ta có thể phân tách protein dựa trên kích thước khi chúng di chuyển tới điện cực dương.

  • Giới thiệu về SDS PAGE, xem tại đây 
  • Chạy điện di mPAGE® Gel với hệ thống XCell SureLock®, xem tại đây (
  • Chạy điện di mPAGE® Gel với buồng điện di Bio-Rad, xem tại đây 
  • Khắc phục các vấn đề trong chạy điện di, xem tại đây

 

Các protein được phân tách trên gel bằng điện di được cố định bằng cách chuyển lên màng PVDF hoặc nitrocellulose. Quá trình chuyển sử dụng dòng điện để kéo các protein từ gel lên màng.

  • Quy trình chuyển màng, xem tại đây
  • Phương pháp chuyển màng ướt hoặc bán khô, xem tại đây

Protein đích được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể chính kết hợp với kháng thể thứ cấp liên hợp HRP hoặc AP và chất nền hóa học phát quang hoặc đo màu thích hợp, hoặc bằng cách sử dụng kháng thể chính hoặc thứ cấp được đánh dấu huỳnh quang.

Sản phẩm hoá sinh cho Western Blotting, xem chi tiết tại đây

    NHẬN TIN MỚI QUA EMAIL